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DNA甲基化检测识别癌症
来源:美国科学院院报 | 作者:pmo347760 | 发布时间: 159天前 | 331 次浏览 | 分享到:
导读:

2017626日,国际著名学术期刊《美国科学院院刊》在线发表了美国加州大学圣迭戈分校张康教授与中国第四军医大学西京医院郝晓柯教授及中山大学徐瑞华教授等人合作完成的一篇研究论文,研究报道了DNA甲基化标记作为一种全新的微创检测方式,只需检测少量组织即可获得足量的DNA用于分析,且至少可以有效识别结直肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌四种常见恶性肿瘤。

甲基是指一个碳原子和三个氢原子结合。DNA(脱氧核糖核酸)甲基化涉及甲基修饰DNA分子。作为一种最基本的表观遗传学现象,DNA甲基化即在基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因表达发生了改变,是正常发育过程所必需,但它与包括肿瘤发生发展在内的许多重要病理生理过程也密切相关。

以张康教授为首的研究人员利用美中三个肿瘤数据库,分析了约2800个肿瘤样本和约590个相应正常组织的DNA甲基化水平,肿瘤样本包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌四种常见恶性肿瘤。

他们发现,利用特定位点DNA甲基化水平的差异,在三个数据库中区分正常组织和肿瘤组织的准确率超过95%,与传统的诊断方法相当,但样本仅需少量,且过程更加简单快捷。更重要的是,利用结直肠癌特异性的DNA甲基化标记,可准确识别97%的结直肠癌肝转移病灶和94%的结直肠癌肺转移病灶。

研究人员指出,由于约10%的肿瘤首先表现为转移性病灶,其中一部分经过各种检查,原发病灶始终未知,所以DNA甲基化标记能够准确判断肿瘤的组织来源,对于选择正确的肿瘤治疗方法、提高患者的生存预期具有重大意义。

张康说:“这种方法的一大优势在于只需要少量的组织即可获得足量的DNA用于分析,这将减少组织活检造成的损伤,并降低病理诊断对活检组织结构的依赖,或能允许使用未知原发肿瘤来源的转移病灶组织进行检测。

他还表示,虽然他们的研究目前只报告了四种最常见的恶性肿瘤,但预计相关dna甲基化检测技术可以很容易地扩展到更多常见肿瘤的诊断。

精读:

研究人员将TCGA(癌症基因组图谱)中1,619个肿瘤样本和173个相邻的正常组织样本作为训练组,确定了甲基化标志物。然后将癌症标志物应用在验证组。验证组分为两类,验证组1TCGA(排除训练组中的基因组)中791个肿瘤样本和93个相邻正常组织样本;验证组2:病人组织活检中394个肿瘤样本和324个相邻正常组织样本(病人样品来自中山医院、华西医院和西京医院)。

 

确定癌症特异性的甲基化标志

首先研究人员用lasso (least absolute shrinkage and selection operator)的函数模型对TCGA训练组进行分析,确定了四种癌症(乳腺癌、结肠癌、肝癌和肺癌)的甲基化标志物。标志物在TCGA训练组中的诊断正确率为98.4%(如表1所示),即标志物可以用来区分癌症组织和正常组织。之后研究人员将这些癌症标记物应用于TCGA验证组中(表2),诊断正确为97.1%。最后将甲基化标志物应用于患者验证组中,结果如表3所示:诊断正确率有所降低但仍旧能达到95.0%。因此,甲基化标志物是可以用来区分恶性肿瘤和正常组织的(图1)。


表一 测试组的混淆矩阵



表二 TCGA验证组的混淆矩阵

表三 患者验证组的混淆矩阵


橘色代表癌症样品,紫色代表正常组织样品,灰色代表验证组中正确诊断的样品

图一

甲基化特征可以从正常组织中区分出不同类型的癌症。(A)不同癌症的甲基化图谱的非监督层次聚类和热图(BROC曲线表明甲基化在预测不同癌症类型上有很高的灵敏度和特异性。(CB图中方框区的放大视图。


甲基化块结构来提高等位基因预测的准确性

甲基化块结构建立方法(Methods):研究员使用遗传连锁不平衡的概念来研究不同DNA链段间的甲基化程度,然后用双末端Illumina测序读取法来确定每个独立的甲基化块(mBlock),之后用皮尔森相关系数法来量化mBlock的共甲基化程度。最后通过计算每个mBlock甲基化得分占总得分的比例,研究人员编译了一个基因区域所有的mBlock。运用上述方法研究人员将基因组划分为几个共甲基化CpG位点块,每个共甲基化CpG位点块被称为MCBs。然后研究人员分析了癌症组织和正常组织中的MCBs,发现MCBs的区域划分在四种癌症组织和正常组织中有很高的一致性。研究人员发现约3600MCBs,但其中大约一半是不完整或中断的。接下来研究人员确定了每个MCBs的复合甲基化值:计算一个MCB中每个CpG位点的甲基化值,之后相加。最后研究人员使用MCBs代替生物信息下游管道中的单个CpG位点,等位基因预测的准确性得到了很大的提高。

 

甲基化图谱识别转移性肝癌

确定转移癌的原发组织对于癌症病人选择最佳治疗至关重要,因此研究人员在患者组中探究了DNA甲基化能否诊断转移性肝癌和转移性肺癌。研究人员分析了30例结直肠转肝癌和34例结直肠癌转肺癌的病例。非监督层次化聚类算法表明这些结肠转移癌与正常组织是有明显区分的(图2)。DNA甲基化可以正确诊断出30例结直肠转肝癌中的29例和34例结直肠转肺癌中的32例(表3)。这其中的一个误诊病例是将结直肠癌肝转移诊断为正常肝脏,另外两个误诊病例是将结直肠癌肺转移诊断为正常结肠组织,可推断误差是由于组织污染造成的。因此,DNA甲基化在诊断转移性癌症方面也有很大的潜力。


图二

DNA甲基化可以确定结肠转移癌的起源。甲基化相关的无监督分级聚类和热图显示了394个肿瘤样本、324例正常样本以及来自医院患者的原发性和转移性结肠直肠癌、肝癌和肺癌样本中的46CpG标志物。每一列代表一个单独的病人,每一行代表一个单独的CpG标记。颜色条带的变化代表相对的甲基化程度。


甲基化图谱可评估预后和预测生存率

研究人员分析了甲基化图谱对每类癌症的预后评估能力。在构建模型时,临床和人口学特征都被纳入分析范围,因为年龄,性别,种族以及美国癌症联合委员会的癌症分期等信息都可以提高预测能力。并且对于每种癌症类别,研究人员都使用两种不同的统计学习算法,lassoboosting,有效地降低了标记物的维度。最后研究人员将预后模型应用在TCGA训练组和验证组,评估结果与经典生存分析Kaplan-Meier法一致,能够明确区分低风险组和高风险组(图3)。因此,甲基化图谱可进行预后和生存率的预测。



图三

甲基化可以预测不同癌症类型患者的总体生存率。(A)根据lasso算法的综合预后评分,得到的BRCA(乳腺癌)和LUAD(肺腺癌)患者的总体生存曲线(Cox回归曲线和Kaplan-Meier)。(B)根据boosting算法的综合预后评分,得到的BRCALUAD患者的总体生存曲线(Cox回归曲线和Kaplan-Meier)。


基因表达模式和功能相关的癌症甲基化谱

DNA甲基化是基因表达的一个重要的表观遗传调节因子,因此研究人员探究了癌症和正常组织中与基因表达相关的位点的甲基化差异性。如Methods中所述,我们通过甲基化信息和RNA测序数据在肝细胞肝癌(LIHC)中的寻找最显著CpG标记物,这些区域中DNA甲基化和基因表达密切相关。正如预期,启动因子的甲基化与基因表达之间成反比,几个重要的致癌基因以及与LIHC相关的功能未知的基因也被发现。在LIHC的这些启动因子中,我们验证了其中的FUZ基因并且证明了 FUZ基因的过度表达会抑制LIHC细胞生长(图4)。

图四

LIHC样本中将不同的甲基化标记物与基因表达联系起来。(ACpG甲基化标志物cg19763319FUZ基因表达的关系。红点代表正常组织样本,黑点代表癌症样本。(BFUZ基因表达对HEP1肝癌细胞系生长的影响。(C)在小鼠异种移植模型中FUZ基因表达对HEP1肝癌细胞系生长的影响。(DFUZ基因表达对HEP1细胞系形成的影响。(E)将FUZ影响的HEP1细胞系形成和正常对照组进行量化


讨论

本研究表明DNA甲基化可以用来识别转移癌的原生组织及评估癌症预后。 虽然这篇文章的研究仅限于四种常见的癌症,但DNA甲基化分析方法可以很容易地推广到诊断更多的其他癌症。并且这种方法在组织样本的量和品质都得不到保证的情况下对癌症的诊断更有帮助,因为DNA甲基化分析只需要少量的组织样品便能获得足够的DNA,对于活检组织的质量要求也相对较低。这些研究对转移性病变分析和诊断具也有重要的实用价值,特别是对未知原发转移癌。

对重亚硫酸钠处理后的DNA测序,研究人员确定了许多以前未知的可以用来区分癌组织和正常组织的CpG甲基化标志物。之前Lehmann-Werman等人描述了多个相邻CpG位点具有相同的组织特异性的DNA甲基化模式。在这篇文章中研究人员进行了更深层次的研究并引入mBlock这个概念,发现许多相邻CpG位点的甲基化标志物有很高的一致性。这个概念可以提高癌症DNA甲基化分析的准确性和扩大诊断标志物的数量。

DNA甲基化特征可以用来观测患者的癌症发展情况,也可以用来进行区分惰性肿瘤和侵袭性肿瘤,根据此信息就可以对患者制定最优化治疗方案。因此有必要对甲基化测序进行充分探究,来实现癌症的个性化诊断和护理。


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文章引用声明:

导读来源:生物帮 http://www.bio1000.com/periodical/pnas/507185.html
精读翻译:张子谋